Beca 2001

“Química aplicada a la economía nacional en el área de las proteínas de los alimentos transgénicos”

El jurado de selección estuvo integrado por:

  •     Prof. Dr. Eduardo Castro
  •     Prof. Dra. Cristina Añon
  •     Prof. Dr. Marcelo Vernengo
  •     Ing. Antonio Calvelo
  •     Dr. Oscar Cuper 

Becado:  

La selección entre los excelentes candidatos presentados, dio como resultado que obtuviera la beca de referencia el Dr. Hugo Permingeat, de la provincia de Santa Fe, quien presentó el proyecto denominado “Expresión de genes codificantes de proteína Bt en híbridos de maíz cultivados en la Argentina y su presencia en alimentos derivados”.

El Rotary Club de Buenos Aires agradece y felicita a los candidatos postulados por el nivel académico de presentación.

INFORME DE AVANCE PERÍODO ENERO-MARZO 2002

TEMA: QUÍMICA APLICADA A LA ECONOMÍA NACIONAL EN EL ÁREA DE LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS TRANSGÉNICOS.

Dr. Hugo Permingeat

Durante el período correspondiente al primer trimestre de la Beca Dr Ambrosio Tognoni “Expresión de genes codificantes de proteína Bt en híbridos de maíz cultivados en Argentina y su presencia en alimentos derivados”, se han desarrollado las siguientes actividades:

a) Cosecha de choclos de distintos híbridos transgénicos en lotes de producción y/o experimentación. Se han realizado visitas a campos de productores y a lotes de experimentación para obtener muestras de distintos híbridos de maíz transgénicos correspondientes a los eventos de transformación autorizados para su comercialización en Argentina : MON810 y 176. Entre los primeros, se obtuvieron espigas de los genotipos 30R76MG, 33Y02MG y 32G63MG, mientras que de los segundos se cosecharon espigas de los genotipos PUCARÁ TD y CHALTEN TD. También se cosecharon espigas de híbridos no transgénicos con el objetivo de utilizarlos como control en los sucesivos análisis del proyecto. Estos últimos incluyeron los genotipos 30F82 y PUCARÁ. Las espigas cosechadas con alto porcentaje de humedad se secaron en estufa a 45°C durante 3 días.

b) Toma de muestras de suelo. Con el objetivo de estudiar la eventual residualidad de la proteína BT en suelos cultivados con maíces transgénicos, se tomaron muestras de suelo donde estaban cultivados los híbridos mencionados anteriormente. También se tomaron muestras de controles (suelos cultivados con maíces no transgénicos).

c) Adquisición de alimentos elaborados con maíz como ingrediente. En el presente período se han adquirido distintos alimentos presentes en góndolas de supermercados, incluyendo marcas de polentas comunes (Frontón e Indelma) y precocidas (Indelma, La Egipciana, Arcor y Presto Pronta), y hojuelas de maíz (Granix, Nutridía, 3 Arroyos y Kellogs).

d) Adquisición de un kit de diagnóstico de inmunodetección de proteína BT ( cryIA(b/c). Se adquirió un kit de inmunodetección por ELISA de la proteína codificada por los genes Bt introducidos en maíz por ingeniería genética. Este kit se importó de Estados Unidos gracias a una donación de la Fundación Helios. El mencionado kit fue diseñado para detectar y cuantificar la proteína BT en muestras de tejido de plantas y granos con una sensibilidad de 0,14 ppb. El mismo ya se encuentra en el laboratorio para su utilización.

e) Obtención de anticuerpos para la detección de proteínas endógenas de maíz. Se estableció un contacto con el Dr. Brian Larkins, científico especialista en zeínas de maíz de la Universidad de Arizona, Estados Unidos, para solicitarle anticuerpos específicos de estas proteínas de maíz. Estos anticuerpos se utilizarán como controles en los extractos proteicos obtenidos de las muestrasexperimentales de alimentos.

f) Organización de los análisis. Dado el elevado costo del kit de inmunodetección por ELISA importado de Estados Unidos, y para lograr una optimización de su uso, se decidió modificar el procedimiento de análisis de muestras (alimentos, granos, suelo, tejidos vegetales, etc.). Inicialmente se correrán reacciones de PCR con oligonucleótidos específicos de los fragmentos presentes en los genes BT introducidos, y en aquellas muestras que confirmen poseer el gen buscado se analizará la presencia de la proteína. Para ello, se sembrarán filtros de nitrocelulosa con proteína extraída de las muestras en análisis y se realizará una inmunodetección de proteínas de maíz mediante el uso de los anticuerpos contra zeínas gentilmente cedidos por el Dr Larkins. (Las zeínas son las proteínas más abundantes presentes en el grano de maíz). Aquellas muestras que revelen la presencia de zeínas en el dot blot serán analizadas por ELISA con el kit de detección y cuantificación de la proteína BT. Estos cambios modifican el cronograma oportunamente presentado, dado que los resultados de los análisis de los alimentos se concentrarán luego de asegurarnos la presencia de proteínas de maíz en las muestras bajo análisis.

g) Avance de los análisis. De acuerdo a la organización de los análisis mencionados en el ítem anterior, se realizaron extractos de DNA de las muestras de granos cosechados, polentas y hojuelas de maíz mediante la técnica de CTAB (Niederhauser et al, 1996). En el caso de los granos, los mismos se partieron en mitades, destinando una de ellas a la extracción de DNA y la otra a la extracción de proteínas. Estas mitades se molieron en mortero para realizar las respectivas extracciones, al igual que las muestras de hojuelas de maíz. Los extractos de DNA se evaluaron y cuantificaron en geles de agarosa 1 %, y se sometieron a reacciones de PCR con oligonucleótidos que reconocen genes de zeínas (genes endógenos de maíz) para evaluar la presencia de inhibidores de la polimerasa, y con oligonucléotidos que reconocen fragmentos de los genes BT introducidos en los maíces transgénicos cultivados en el país. El rendimiento de DNA de cada tipo de extracto fue variable, siendo visible en el gel para el caso de los granos y de las polentas crudas, menor en el caso de las polentas precocidas e invisible en el caso de las hojuelas de maíz. Se observaron bandas de amplificación de PCR correspondientes a fragmentos de zeínas en los extractos de DNA derivados de granos y de polentas, no en las muestras de hojuelas, sugiriendo que el DNA en este alimento procesado está lo suficientemente degradado, o que existen inhibidores de la enzima responsable de la amplificación en el extracto de DNA. Actualmente se está modificando el protocolo de extracción mediante la incorporación de DNA carrier en la muestra para mejorar la extracción y observar si se pueden detectar los amplicones de los genes endógenos (zeínas). Los análisis de amplificación del fragmento del gen CryIA(b) indicaron las muestras de granos y polentas que contienen maíz transgénico como ingrediente. Estos análisis fueron confirmados con una segunda reacción que amplifica un fragmento del promotor 35S presente en las unidades transcripcionales de los genes introducidos en los dos eventos en estudio (MON810 y 176). Dentro del grupo de polentas analizadas, el extracto de DNA de una de ellas reveló la presencia de maíz transgénico, mientras que las otras generaron amplicones para el gen endógeno pero no para el transgen. Más recientemente se inició la extracción de proteínas de muestras de los tres tipos de materiales analizados hasta el momento: granos, polentas y hojuelas, utilizando los buffers descriptos por Sims and Berberich (1996). Para cuantificar la proteína presente en los extractos se está utilizando el método de Bradford (1976). El contenido promedio de proteína encontrado está en el orden de 56,5, 11,05 y 12 mg/g para granos, polentas precocidas y hojuelas de maíz, respectivamente.

h) Incorporación de un Tesinista de Licenciatura en Biotecnología. El presente proyecto se ofreció a la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la Universidad Nacional de Rosario para que un alumno de la mencionada carreralogre un entrenamiento y formación en las técnicas de trabajo y obtenga su título de grado después de escribir y defender una tesina sobre el tema en cuestión. El proyecto fue aceptado, y un alumno, el Sr Ezequiel Margarit (D.N.I. 26.528.789) está trabajando como tesinista para satisfacer el plan de trabajo que oportunamente fue diseñado.

 Bibliografía:

Bradford MM. (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem., 72: 248-254. Niederhauser C. et al, (1996). Genetically engineered food plants: Research and detection with DNA-analytical methods. In: Gebiete Lebensm. Hyg., 88:164-175. Sims SR and Berberich SA, (1996). Bacillus thuringiensis CryIA protein levels in raw and processed seed of transgenic cotton: Determination using insect bioassay and ELISA. J. Econ.Entomol., 89: 247-251.

INFORME DE AVANCE PERÍODO ABRIL-JUNIO 2002

TEMA: QUÍMICA APLICADA A LA ECONOMÍA NACIONAL EN EL ÁREA DE LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS TRANSGÉNICOS.

Dr. Hugo Permingeat

Durante el período correspondiente al segundo trimestre de la Beca Dr Ambrosio Tognoni “Expresión de genes codificantes de proteína Bt en híbridos de maíz cultivados en Argentina y su presencia en alimentos derivados”, se han desarrollado las siguientes actividades:

 a) Análisis de Alimentos derivados de maíz:

En el presente período se continuaron haciendo análisis de detección de genes BT sobre alimentos que contienen maíz como ingredientes, dejando los análisis correspondientes a las proteínas para el tercer y cuarto período, y así optimizar el uso de los kits de detección y cuantificación como se explicó en el informe anterior. Los resultados y conclusiones logrados en el presente período incluyen los siguientes puntos:

a-1). En el informe previo se confirmó que sólo una polenta de seis analizadas contenían maíz transgénico, descartando del análisis a las 5 restantes. Con el objetivo de identificar el evento presente en la muestra se desarrollaron experimentos de PCR con oligonucleótidos específicos (Studer et al, 1997; Matzuoka et al, 2001) de los 2 eventos autorizados para su comercializacion (176 y MON810) en forma independiente, encontrando que esta polenta tiene una mezcla de ambos eventos. Una semicuantificación de cada evento reveló que la muestra contiene mayoritariamente maíz MON810 (más del 80 %) y trazas del evento 176 (aproximadamente un 0,4 %). Un extracto proteico de esta polenta será analizada para la detección y cuantificación del polipéptido codificado por el gen BT.

a-2). Dados los resultados negativos encontrados en el período previo de obtener DNA de las 4 muestras de hojuelas de maíz analizadas, se ensayaron otros métodos de extracción tales como la extracción con Sílica, con NaOH (Zimmerman et al, 1998), con DNA de soja como carrier, y partiendo de dos cantidades de material. Desafortunadamente, ningún método permitió obtener el DNA requerido para el análisis por PCR. Se continúa trabajando sobre el tema con modificaciones de uno de los métodos (ISO/AFNOR, 2001) para obtener un DNA que permita realizar los análisis previstos. Se estima que la proporción de polisacáridos presentes en las muestras impiden una extracción adecuada de DNA.

a-3). Se incorporaron en este período dos marcas comerciales de chizitos a la lista de los alimentos anteriores (Muestras 11 y 12). Se extrajo DNA de ambos (no visualizados en gel de agarosa), que amplificó débilmente el gen endógeno de zeínas, pero no el amplicón correspondiente al gen BT (Permingeat et al, 2002). Como la concentración del DNA es demasiado baja (0.6 ng/µL en  un volumen final de 40 µL, 25 ng totales de DNA vs 2 µg que se obtienen de grano/harina) -especialmente si éste está en baja proporción en la muestra- se repitió el experimento de PCR usando como templado 1 µL del producto de amplificación del experimento previo, encontrando que la muestra no contiene maíz BT.

a-4). Otro grupo de alimentos que se incorporó al análisis en el presente período es el que corresponde a los balanceados para monogástricos. Estos incluyen 4 alimentos para aves (Ponedoras coloradas –Muestra 13-, Ponedoras blancas –Muestra 14- y para pollos parrilleros –Muestra 15-), 2 alimentos para cerdos (Muestras 16 y 17) y 4 alimentos para mascotas (Muestras 18 y 19 para gatos y Muestras 20 y 21 para perros). Estos alimentos incluyen moliendas, granulados y pelleteados. El DNA extraído por el método de CTAB resultó medianamente satisfactorio, ya que si bien se visualizó DNA de todos los extractos en el gel de agarosa, sólo amplificaron el gen endógeno de zeínas los alimentos de aves, los de cerdos y el balanceado de perros “Muestra 20”. Los restantes balanceados de mascotas que no amplificaron el gen de zeínas se sumarán al método modificado que se utilizará para las hojuelas de maíz (ver ítem 2). De los alimentos que amplificaron el gen de zeínas, sólo dieron bandas de amplificación del gen BT los alimentos balanceados para cerdos y la Muestra 15 para pollos parrilleros. Estos, al igual que la polenta discutida en el ítem 1, serán analizados tanto para identificar el evento y la cantidad de transgénico como para detectar y cuantificar la proteína BT presente en la muestra. Los alimentos que dieron negativos los experimentos de PCR del gen BT serán descartados del análisis.

a-5) Todos los alimentos analizados previamente por PCR para detectar la presencia del gen CryIA(b) fueron también sometidos a un análisis de PCR para detectar el gen epsps presente en el evento GA21, aunque no fuera inicialmente considerado en el cronograma ni en el plan de trabajo del presente proyecto. El evento GA21 es un maíz transgénico resistente a glifosato (Maíz RR), legalmente flexibilizado en Argentina pero no autorizado para su comercialización. A causa de que el pasado 25 de abril el diario La Nación publicó un artículo en el que el grupo ambientalista Greenpeace habría detectado este evento en una polenta proveniente de Argentina en un supermercado de la ciudad de Zurich, hemos utilizado oligonucleótidos específicos (Matsuoka et al, 2001) para el análisis de los distintos alimentos considerados en el presente proyecto. Como resultado encontramos que los mismos no fueron elaborados con maíz del evento GA21.

b) Siembra de materiales transgénicos:

Se sembraron semillas de los tres eventos de maíz transgénico (176, MON810 y BT11) y un control no transgénico con el objetivo de evaluar los niveles de expresión del gen CryIA(b) en los distintos tejidos de maíz. Estas plántulas se conducirán a madurez, para lo que ya están creciendo en condiciones de invernadero con termoperíodo de 30 y 18°C (día-noche) y un fotoperíodo de 16-8 hs. Extractos de proteínas de hojas de estas plantas se utilizarán para ajustar las condiciones de un Western blot donde se utilizarán anticuerpos policlonales contra la proteína BT codificada por el gen CryIA(b) desarrollado en el laboratorio por un proyecto previo. Estos anticuerpos, que son de bajo título, fueron generados en conejos. Si se ajustan las condiciones del Western, permitirán generar datos sobre la integridad de la proteína BT presente en los alimentos que la contengan. Si bien esta técnica no estaba prevista en el cronograma original, puede aportar información importante sobre la estabilidad de la proteína después de diferentes procesos de fabricación de alimentos.

c) Ajuste de condiciones de hidroponia:

Se ajustó el protocolo del cultivo en hidroponia de las plántulas para conocer los niveles de rizosecreción de proteína BT, de acuerdo a lo planteado en el proyecto original. Las condiciones establecidas consideran un crecimiento de las plantas en una cámara de cultivo (temperatura de 26°C – fotoperíodo 16:8 hs), en medio de las sales MS a mitad de concentración, aireadas las raíces con un burbujeador de pecera, y encerradas las raíces en una membrana de diálisis para concentrar las proteínas rizosecretadas. Estas plántulas se originan de semillas previamente desinfectadas con etanol e hipoclorito de sodio, y crecidas en condiciones ascépticas hasta el momento de iniciada la hidroponía. El cultivo en estas condiciones permitió obtener datos que la rizosecreción de proteínas totales está en el orden de 100 µg por planta. El cultivo bajo las condiciones descriptas se iniciará con los diferentes eventos y un control en el transcurso del mes de agosto. Esta actividad se había iniciado, de acuerdo a lo programado en el cronograma de la beca, durante el período que cubre este informe, pero se interrumpió debido a la rotura de la cámara donde estaban creciendo las plantas.

d) Bibliografía:

ISO/TC34 WG7 N 26. (2001). Detection of genetically modified organisms and derived products. Qualitative nucleic acid based methods. Anexes. AFNOR: Saint Denis, La Plaine Cedex, France, pp 47-50. Matsuoka T, Kuribara H, Akiyama H, Miura H, Goda Y, Kusakabe Y, Isshiki K, Toyoda M and Hino A. (2001). A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize. J. Food Hyg. Soc. Jpn., 42: 24-32. Permingeat HR, Reggiardo MI and Vallejos RH. (2002). Detection and Quantification of Transgenes in Grains by Multiplex and Real-Time PCR. J. Agric. Food Chem., 50:            4431-4436      . Studer E, Dahinder I, Lüthy J, Hübner P. (1997). Nachweis des gentechnisch veränderten Maximizer Mais mitels der polymerase-kettenreaktion (PCR). Mitt. Geb. Lebensmittelunters.Hyg., 88: 515- 524. Zimmermann A, Lüthy J and Pauli U. (1998). Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples. Z.Lebensm Unters Forsch A., 207: 81-90.

INFORME DE AVANCE PERÍODO JULIO-SEPTIEMBRE 2002

TEMA: QUÍMICA APLICADA A LA ECONOMÍA NACIONAL EN EL ÁREA DE LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS TRANSGÉNICOS.

Dr. Hugo Permingeat

Durante el período correspondiente al tercer trimestre de la Beca Dr Ambrosio Tognoni “Expresión de genes codificantes de proteína Bt en híbridos de maíz cultivados en Argentina y su presencia en alimentos derivados”, se han desarrollado las siguientes actividades:

a) Análisis de Alimentos derivados de maíz:

En el presente período se continuaron haciendo análisis de detección de genes BT sobre alimentos que contienen maíz como ingredientes y se comenzó con la extracción de proteínas para detectar la delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis, actividad que se desarrollará durante el cuarto período. Los resultados y conclusiones logrados en el presente trimestre incluyen los siguientes puntos:

a-1) Dos polentas precocidas de un total de nueve analizadas (5 para cocer y 4 precocidas) resultaron positivas en el análisis de detección de genes BT (Una de éstas fue informada en el período anterior, incluyendo una semicuantificación de cada evento). La segunda polenta en la que se detectó la presencia del gen BT fue sujeto de un análisis de semicuantificación de eventos. Los resultados del mismo mostraron que ambos eventos están presentes en la polenta en proporciones que alcanzan aproximadamente 10 % de MON810 y 1 % de E176.

a-2) Otros alimentos que se sumaron al análisis durante el presente período fueron 2 aceites comerciales de maíz, 1 marca de kero y 2 marcas de granos partidos para locro/guiso. Para ello se utilizó un método de extracción de DNA basado en el detergente CTAB, previo tratamiento con hexano en el caso de losaceites. Para aumentar la eficiencia extractiva se agregó DNA de soja como carrier en la mezcla con hexano. Una amplificación específica de lectinas de soja por PCR reveló la recuperación del ADN carrier en los aceites, pero no fue posible amplificar el gen de zeínas lo que indica que no quedan residuos de ADN en el aceite de maíz. En el caso del kero no fue siquiera posible recuperar el DNA carrier, o el escaso DNA extraído incluyendo el carrier resultó con inhibidores de la Taq polimerasa para lograr la amplificación, al igual que el obtenido de las hojuelas de maíz comentadas en el informe previo debido al alto porcentaje de polisacáridos. Las dos muestras de granos partidos para locro dieron positiva la reacción de zeínas y también se detectó el gen BT. En estos últimos se detectaron los dos eventos enproporciones de 10 % para el evento MON810 y 1 % para el evento E176.

a-3) El grupo de alimentos balanceados que se incorporó al análisis durante es trimestre anterior y que resultó positivo en la detección del gen BT, fue ahora sujeto de un análisis de identificación y semicuantificación de eventos. Así se determinó que los dos alimentos para cerdos contienen más del 90 % de maízMON810 y aproximadamente 0,5 % de E176 y que el alimento para pollos parrilleros contiene proporciones cercanas al 50 % de cada uno de los eventos mencionados.

a-4) Extractos proteicos de las muestras BT positivas por PCR están siendo analizados para la detección y cuantificación del polipéptido codificado por el gen BT. Por ejemplo, un primer ensayo con proteínas incluyó la extracción a partir de tejidos frescos de plantas del evento BT11 (hoja, tallo y raíz), de polenta, de granos partidos, de granos del evento BT11 y de un alimento balanceado. Las muestras se molieron en frío con N2 líquido y se las homogenizó en 250 µL de buffer de extracción en tubos eppendorf, se centrifugaron a 14000 rpm a 4°C durante 10 min, y se cuantificaron por Bradford. Diez µg de cada una se corrió en una electroforesis SDS-PAGE (10% poliacrilamida), cuyos resultados se muestran en la Figura 1.

b) Cultivo Hidropónico de Maíz:

Con el objetivo de estudiar los niveles de rizosecreción de maíz, y en especial dela proteína BT, se cultivó el evento MON810 en las condiciones hidropónicas explicitadas en el informe de avance del trimestre anterior. Se cosechó el medio nutritivo de tres plántulas semanalmente durante un período total de 5 semanas con el fin de evaluar la variación de rizosecretados en función del tiempo. Los rizosecretados fueron clarificados por centrifugación a 9000 rpm (centrífuga Sorvall, rotor SS34) durante 30 min y 4ºC. Los sobrenadantes se concentraron en CentriconTM YM-30 (Amicon), con un corte de 30 KDa a 3500 rpm en una centrífuga Sorvall (rotor SS34) a 4°C. Las muestras se cuantificaron por Bradford, y posteriormente se liofilizaron para conservarlas y analizarlas posteriormente para detectar y cuantificar la proteína BT en el último período de la beca. Actualmente se está desarrollando el cultivo hidropónico del evento BT11 en las condiciones descriptas. Los datos de rizosecreción para el evento MON810 se muestran en la Tabla 1. Es de destacar que las membranas de diálisis utilizadas permiten concentrar solutos con un corte de 30 KDa, por lo que la proteína BT queda retenida en la bolsa por tener un peso molecular de 60 KDa.

Tabla 1. Rizosecreción del evento MON810 a lo largo de 5 semanas de cultivo hidropónico.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5

 

Semana

µg proteínas totales

Semana µg proteínas totales ± DE

1 9,00 ± 1,58

2 23,27 ± 4,94

3 23,71 ± 2,21

4 49,12 ± 2,25

5 67,42 ± 9,18

 c) Cultivo de Híbridos de Diferentes Eventos:

Los distintos híbridos de maíz están creciendo en condiciones de campo para proveer los distintos tejidos de las plantas y evaluar el correspondiente nivel de expresión de la proteína en cuestión. Ya se ha cosechado parte del material de cada uno de los eventos, y se están realizando las extracciones proteicas para el test de ELISA. Los extractos proteicos se cuantificaron por Bradford y se conservan en freezer para un análisis conjunto.

 

INFORME DE AVANCE PERÍODO OCTUBRE-DICIEMBRE 2002

TEMA: QUÍMICA APLICADA A LA ECONOMÍA NACIONAL EN EL ÁREA DE LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS TRANSGÉNICOS.

Dr. Hugo Permingeat

Durante el período correspondiente al cuarto trimestre de la Beca Dr Ambrosio Tognoni “Expresión de genes codificantes de proteína Bt en híbridos de maíz cultivados en Argentina y su presencia en alimentos derivados”, se han desarrollado las siguientes actividades:

a) Análisis de Alimentos derivados de maíz:

En el presente período se finalizó el análisis de alimentos derivados de maíz previsto en el proyecto. Inicialmente se realizó un análisis de detección del gen CryIA(b) por PCR, como se describió en informes previos, después de realizar la amplificación de un fragmento de un gen endógeno como las zeínas (Figura 1). El número total de muestras analizadas fueron 38, compuestas por polentas, granos partidos para locro, hojuelas de maíz, chizitos, aceites, kero, alimentos balanceados para monogástricos y granos tomados de muestras de campo, como se muestra en la Tabla 1. Los resultados de los análisis de PCR se confirmaron por una hibridización Southern de los productos de amplificación, después de ser éstos transferidos a una membrana de nylon e hibridados con una sonda específica derivada del gen CryIAc (Figura 2).

 Figura 1. Amplificación por PCR del ADN de muestras de alimentos..

(a)   Amplificación del gen CryIA(b) codificante de la proteína BT,

(b) amplificación de un fragmento de un gen de zeínas utilizado comocontrol interno de PCR

Tabla 1. Muestras analizadas de alimentos y granos por PCR.

Alimentos y granos Cantidad PCR BT+

Polentas para cocer 5 1

Polentas precocidas 4 2

Granos partidos para locro 2 2

Hojuelas de maíz 4 a(4)

Chizitos 2 0 – a(1)

Aceites 2 0

Kero 1 0

Alimentos balanceados para aves 4 1 – a(1)

Alimentos balanceados para perros 3 a(3)

Alimentos balanceados para gatos 3 0

Alimentos balanceados para cerdos 2 2

Granos 6 4

Total 38 12

Alimentos con DNA no amplificable por PCR. El número entre paréntesis indica cuántos alimentos se encontraron en esta condición.

Figura 2. Hibridización Southern de los productos de amplificación de PCR de muestras de alimentos.

M: marcador de peso molecular; 1-10: muestras de alimentos; 11-12:controles de materiales no transgénicos; w: agua; +: control positivo.

En ocho de las muestras positivas (excluyendo los granos) se hizo una semicuantificación por PCR de la presencia específica de los eventos E176 y MON810, datos que se muestran en la Tabla 2. En ella puede observarse que la presencia del evento MON810 fue siempre superior a la del E176, excepto para dos casos específicos que se encontraron ambos eventos en igual proporción. Estos datos concuerdan con los datos disponibles de una mayor adopción del evento MON810 en nuestro país.

Tabla 2. Semicuantificación por PCR de los eventos presentes en las muestras de alimentos detectadas como positivas para el gen CryIA(b).

Alimento %MON810 %E176

Polenta precocida 1 4 0.4

Polenta precocida 2 10 1

Polenta para cocer 0.4 0

Granos para locro 1 50 0

Granos para locro 2 1 1

Alimento Balanceado para aves 50 50

Alimento Balanceado para cerdos 1 95 0.5

Alimento Balanceado para cerdos 2 8 0.1

Como se describió en informes previos, de algunas de estas muestras no fue posible obtener DNA de la calidad requerida para el análisis de PCR (dato  indicado en la Tabla 1), y por ello fueron analizadas directamente buscando la proteína BT por el método de ELISA. El mismo método (ELISA) también se aplicó para cuantificar la presencia de la proteína BT en los alimentos positivos. Para ello, se siguió el protocolo sugerido por el fabricante del kit adquirido (ENVIROLOGIX), utilizando el propuesto para muestra de granos. Como referencia se hizo una extracción de una muestra de harina de maíz del evento MON810, con lo que se midió la eficiencia de extracción de proteínas y de detección, y se agregó una cantidad de proteína tal que se encuentre en el rango de detección según que evento esté presente en el alimento. Los resultados obtenidos para los alimentos analizados se resumen en la Tabla 3, donde puede observarse que no siempre son coincidentes con los mostrados en los análisis de detección por PCR, presumiblemente como consecuencia de una degradación de las proteínas en el procesamiento del alimento. Por otro lado, el análisis de ELISA mostró que algunos alimentos tales como las hojuelas de maíz, de donde no fue posible obtener DNA amplificable, no contienen maíz genéticamente modificado, o al menos éste es no detectable. El análisis dealgunos alimentos se muestra en la Figura 3.

Tabla 3. Concentración de proteína BT y % de OGM en las muestras, según análisis de ELISA.

Alimento Conc. de prot. BT (ng BT /gr de tej) % OGM en la muestra

Polenta precocida 1 (a) 24,1 9

Polenta precocida 2 (a) 93,9 35,4

Polenta para cocer (a) 0,01 0,005

Granos para locro 1 (a) 37,8 14,25

Granos para locro 2 (a) 0,21 0,32

Alimento Balanceado para aves (a) 4,36 1,66

Alimento Balanceado para cerdos 1 (a) nd nd

Alimento Balanceado para cerdos 2 (a) 0,06 0,023 4 Hojuelas de maíz (b) nd nd Chizitos (b) nd nd

Alimento balanceado para aves (b) 7,9 2

2 Alimentos balanceados para perros (b) nd nd

(a) Muestras detectadas previemente por PCR, (b) Muestras analizadas directamente por

ELISA. nd, no detectable.

Figura 3. ELISA utilizado para la detección y cuantificación de proteína BT.

A-1/4: curva de calibración (a: 0; b: 0.05; c: 0.25; d:0.5 ng de proteína BT). A-5/8, B-1/4 y B-5/8: hoja, raíz, polen y barbas de los eventos E176, MON810 y BT11, respectivamente. C-1/8: muestras de hojuelas de maíz (duplicados); D-1/2: muestras de alimentos balanceados de aves; D-3/6: muestras de alimentos balanceados de perros; D-7/8: muestra de chizitos.

b) Cosecha de materiales transgénicos sembrados para estudios de expresión:

Se cosecharon porciones de hoja, raíz, polen y barbas de los tres eventos de maíz transgénico (176, MON810 y BT11) y de un control no transgénico con el objetivo de evaluar los niveles de expresión del gen CryIA(b) en los distintos tejidos de maíz. Algunos de los resultados de proteína BT en plantas se muestran en la Figura 3. Los datos encontrados ajustan a lo publicado por las empresas en los respectivos informes técnicos (AGBIOS)

c) Cultivo hidropónico de plantas de maíz – Estudios de rizosecreción:

Se completó el cultivo hidropónico de dos eventos transgénicos (MON810 y E176), estando en desarrollo el tercer evento (BT11). Los datos obtenidos se muestran el la Tabla 4, donde se observa un aumento lineal de proteínas totales  rizosecretadas del evento MON810 hasta la quinta semana analizada, y una  curva muy variable del evento E176 debido a una contaminación del medio a partir de la tercer semana de cultivo, por lo que será necesario repetir el ensayo. Una muestra de plantas correspondientes a la cuarta semana de cultivo hidropónico del evento MON810 se muestra en la Figura 4.

Tabla 4. Rizosecreción proteica de eventos transgénicos de maíz.

µg proteínas totales/planta ± DE

Semana

MON810 E176 BT11

Primera 9,00 ± 1,58 14,4 ± 8,5 18,3 ± 3,4

Segunda 23,27 ± 4,94 24,6 ± 11,2

Tercera 23,71 ± 2,21 14,9 ± 1,9

Cuarta 49,12 ± 2,25 26,6 ± 4,5

Quinta 67,42 ± 9,18 15,3 ± 4,6

en desarrollo

 

Figura 4. Plantas crecidas en condiciones hidropónicas del evento MON810 después de cuatro semanas de cultivo.

 d) Conclusiones:

En este informe se resumen los resultados logrados después de analizar una serie de alimentos de diferentes orígenes y marcas que contienen maíz como ingrediente. En algunos casos la detección de organismos genéticamente modificados pudo realizarse por amplificación por PCR de un fragmento del gen introducido  [CryIA(b)], y en otros casos por detección de la proteína que este gen codifica por un método inmunológico como el ELISA. La integridad de la proteína BT en el alimento depende del proceso a que el maíz haya estado sometido en la producción del mismo. La presencia del evento MON810 en alimentos fue superior a la del evento E176, en acuerdo con la adopción de los mismos por los productores. La expresión de los genes introducidos en los diferentes tejidos de las plantas provenientes de distintos eventos es coincidentes con los datos publicados en las bases de datos disponibles (AGBIOS). Como se indicó oportunamente, este trabajo se ofreció a la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la Universidad Nacional de Rosariopara que un alumno de la mencionada carrera logre un entrenamiento y formación en las técnicas de trabajo y obtenga su título de grado después de escribir y defender una tesina sobre el tema en cuestión. El proyecto fue aceptado, y el Sr Ezequiel Margarit (D.N.I. 26.528.789) está trabajando como tesinista. El plan de trabajo planteado oportunamente se completará con un estudio de la estabilidad de la proteína BT en alimentos mediante la técnica de Western blot utilizando anticuerpos específicos, y la cantidad de proteína BT rizosecretada se estudiará por ELISA utilizando los extractos proteicos de lassoluciones donde las plantas crecieron en concidiones hidropónicas. También se analizará la presencia de genes y proteínas BT en muestras de suelo de lotes de maíz. Estos resultados se presentarán en un informe complementario tan pronto se disponga de ellos. Además, oportunamente se enviará al Rotary una copia de la Tesina de Grado del Sr Margarit, la cual contendrá toda lainformación del presente proyecto.

e) Bibliografía:

Envirologix Application Guide (2003). GMO Monitoring Kits.

http://www.envirologix.com/library/ap003bulkgrainag.pdf

AGBIOS GM DATABASE. (2003). http://www.agbios.com/dbase.php.

Beca Interna de Investigación EGD Dr. César A. Tognoni 2002

Sobre “Química aplicada a la economía nacional en él

Área de las proteínas de los alimentos transgénicos.”

Conclusiones del becario Dr. Hugo Permingeat acerca de su trabajo de investigación denominado “Expresión de genes codificantes de proteína Bt en híbridos de maíz cultivados en la Argentina y su presencia en alimentos derivados”

La beca EGD Dr. César A. Tognoni tuvo como objetivo la determinación de la proteína Bt en alimentos, el estudio de los niveles de expresión del gen Bt en híbridos de maíz transgénico y el estudio de la rizosecreción de proteínas Bt en el suelo. Para satisfacer el objetivo principal se analizó la presencia de proteínas Bt en alimentos que contienen maíz como ingrediente básico. Las proteínas Bt provienen de la expresión de un gen de la bacteria Bacillus thuringiensis introducido en maíz por técnicas de ADN recombinante para conferir resistencia a insectos lepidópteros. Así, hoy el productor agropecuario puede cultivar diferentes híbridos derivados básicamente de tres eventos independientes de transformación genética autorizados para la comercialización en Argentina, denominados E176, Mon810 y Bt11. Estos tres eventos muestran una expresión característica en la planta, por lo que los granos de maíz derivados de cada evento acumulan diferentes cantidades de proteína Bt. Estos maíces gozan de ventajas en el campo dado que se les incorporó una defensa contra el ataque de insectos que producen pérdidas que pueden llegar al 48 % de la cosecha en años de alta infestación. La adopción de estos materiales transgénicos por parte de los productores en la presente campaña alcanzó al 35 % del área maicera. Sin embargo, distintas agrupaciones ecologistas y asociaciones de consumidores cuestionan su uso sin fundamentos científicos adecuados.

Los alimentos analizados en el plan de trabajo de la Beca Dr. Tognoni incluyeron distintas polentas (cocidas y para cocer), granos partidos para locro, hojuelas de maíz (cereales), copos de maíz (chizitos), aceites, kero, alimentos balanceados para monogástricos (perros, gatos, cerdos y aves) y granos de maíz. Estos alimentos adquiridos en supermercados fueron analizados para detectar y cuantificar los genes y las proteínas Bt mediante la amplificación de fragmentos específicos de ADN por PCR y la técnica de inmunodetección por ELISA. Los análisis realizados sobre el ADN de 38 muestras de alimentos permitieron determinar que dos polentas precocidas y una para cocer, dos granos partidos para locro y tres alimentos balanceados (uno para aves y dos para cerdos) fueron elaborados con maíz transgénico como materia prima. Un estudio más específico permitió identificar que el maíz utilizado como ingrediente correspondió mayoritariamente al del evento Mon810 (MaizGard), aunque también se encontraron trazas del evento E176. Cuando se realizaron los análisis sobre extractos de proteínas de los alimentos identificados como elaborados con maíz transgénico y se ensayó la técnica ELISA se detectó proteína Bt en algunos de los alimentos (polentas, granos para locro y alimentos balanceados para aves y cerdos), mientras que cuando el alimento deriva de un alto grado de procesamiento para su elaboración (pelleteado, copos y hojuelas de maíz) no se detecta la proteína Bt en el total de las proteínas extraídas del mismo.

Estos resultados sugieren que la proteína Bt no tendría alta estabilidad cuando el grano es sometido a un alto grado de procesamiento para la elaboración del alimento. En los alimentos en los que sí fue posible detectar la proteína Bt se encontraron trazas hasta un máximo de 94 hg de proteína Bt/g de alimento (o sea aproximadamente 0.1 ppm). En otros alimentos tales como aceites y kero no fue posible determinar si el maíz utilizado para su elaboración correspondía a granos transgénicos, dado que no se encontraron restos de ADN ni de proteínas en los mismos para realizar los análisis.

Al margen de los objetivos planteados en el proyecto de la Beca Dr. Tognoni, los mismos alimentos fueron sometidos a un estudio por PCR para detectar el gen epsps presente en el evento GA21. El evento GA21 es un maíz transgénico resistente al herbicida glifosato (conocido como Maíz RR), legalmente flexibilizado en la Argentina pero no autorizado para su comercialización. El mencionado ensayo se realizó dado que el pasado 25 de abril el diario “La Nación” publicó un artículo en el que el grupo ambientalista Greenpeace habría detectado este evento en una polenta proveniente de la Argentina en un supermercado de la ciudad de Zurich. Los resultados encontrados sugieren que los alimentos analizados por el proyecto de la Beca Dr. Tognoni no fueron elaborados con maíz del evento GA21.

Respecto de los otros objetivos del proyecto éstos consistieron en estudios de los niveles de expresión del gen Bt en los diferentes tejidos de las plantas de maíz provenientes de distintos eventos de transformación, en el estudio de la rizosecreción de la proteína Bt en cada evento de transformación y la vida media de dicha proteína en muestras de suelos cultivados con maíces Bt. Los análisis de Elisa realizados sobre distintos tejidos de las plantas de maíz sugieren que los niveles de expresión del gen Bt son coincidentes con los publicados en las bases de datos disponibles (AGBIOS, http://www.agbios.com), confirmando resultados diferenciales entre híbridos derivados de los distintos eventos. Para determinar los niveles de rizosecreción de proteínas Bt se desarrolló un sistema hidropónico, donde las raíces de las plantas de los distintos eventos fueron cubiertas por membranas de diálisis para retener las proteínas. Las proteínas presentes en las soluciones de cultivo donde crecieron las raíces se concentraron y cuantificaron, encontrando un valor cercano a 70 mg de proteínas totales rizosecretadas/planta. Se encuentra aún en estudio aún cuánto de esta cantidad de proteína corresponde a la proteína Bt, lo mismo que cuál es la vida o estabilidad de la proteína Bt en suelos, datos que se harán llegar oportunamente al Rotary Club de Buenos Aires.

Es de destacar que este trabajo se ofreció a la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la Universidad Nacional de Rosario para que un alumno de la mencionada carrera logre un entrenamiento y formación en las técnicas de trabajo y obtenga su título de grado después de escribir y defender una tesina sobre el tema en cuestión. El proyecto fue aceptado, y el Sr. Ezequiel Margarit (D.N.I. 26.528.789) está trabajando como tesinista bajo mi dirección.

Finalmente, quiero expresar mi agradecimiento al Rotary Club de Buenos Aires por haberme dado la oportunidad de realizar el trabajo descripto mediante la adjudicación de la Beca Dr. Tognoni, y a las autoridades del Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos (CEFOBI) de la ciudad de Rosario por haber ofrecido la infraestructura necesaria para el desarrollo de los análisis mencionados.

Dr. Hugo Permingeat

CEFOBI

Suipacha 531 (2000) Rosario

E-mail: permingeath@arnet.com.ar

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Comentarios de nuestro ex becario Dr. Hugo Permingeat

(diciembre de 2005)

“Me resulta particularmente grato dirigirme a Uds. para comunicarles que parte del trabajo realizado durante 2002-2003 en el marco de la beca con que ese Rotary Club me distinguiera ha sido evaluado satisfactoriamente por revisores internacionales. En este contexto, ya se encuentra en Internet y se publicará en la versión impresa correspondiente al número de marzo próximo de la revista Food Research International el trabajo de investigación “Detection of BT transgenic maize in foodstuffs”, por Margarit E. Reggiardo MI, Vallejos RH y quien suscribe. Les informo que el Sr. Margarit, quién desarrolló el trabajo experimental como tesinista de Licenciatura en Biotecnología bajo mi dirección en la misma temática, defendió su tesina en la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la UNR, aprobándola con Sobresaliente.

Agradezco una vez más la confianza que el Rotary Club de Buenos Aires depositó en mi persona y la oportunidad que me brindó para desarrollar este trabajo.

Asimismo, hago oportuna la ocasión para desearles Felices Fiestas en las Navidades que se aproximan y un exitoso año 2006 para todos”.